【佳作分享】中山大学庞冀燕团队JMC论文：通过自噬体锚定嵌合肽靶向降解α-突触核蛋白

α-突触核蛋白（αSyn）在帕金森病和多系统萎缩等突触核蛋白病中扮演着关键的角色。这些疾病的病理特征包括多巴胺能神经元中αSyn的错误折叠和路易小体的异常积聚。因此，针对αSyn的干预被认为是治疗突触核蛋白病的一种策略，而传统的药物化学方法通常难以有效作用于αSyn，大多数调控αSyn的方法通常只能通过影响相关途径中的其它靶点来进行干预。中山大学庞冀燕团队开发了一项名为“自噬体锚定嵌合体（ATACC）”的策略，该策略通过一种具有微管相关蛋白-1轻链-3B（LC3B）结合区域（LIR）的双功能肽的协助，使感兴趣的蛋白（POI）能够锚定到自噬体膜上的LC3B，从而实现了POI的选择性自噬。该团队设计并合成了一系列的αSyn的ATACC肽，它们能够通过化学诱导的载体识别的方式劫持自噬-溶酶体降解机制，特异而高效地降解αSyn，可作为一种针对突触核蛋白病的潜在治疗策略。近期，该项研究工作发表在美国化学会出版的药物化学核心期刊Journal of Medicinal Chemistry上（J. Med. Chem. 2023, 66, 17, 12614–12628）【1】。

在此研究中，研究人员开发了一种名为“自噬体锚定嵌合物（ATACC）”的策略：通过化学诱导的载体识别，将感兴趣的蛋白（POI）通过嵌合肽的帮助锚定到自噬体上，从而促进POI的选择性自噬（图1a）。ATACC肽包括三个主要部分（图1b）：一个PBD(蛋白结合区域)，一个LIR(LC3结合区域)，以及CPP(穿膜肽序列)。PBD和LIR通过一个通用的linker（GSGS）连接， 而N-末端修饰可作为检测标签。

具体来说，对αSyn的选择性识别是通过βSyn的片段（GVLYVGSKTR）实现的，其能够以高度特异性的方式与αSyn结合。另一方面，为了实现对LC3B的精确锚定，选取了三个天然选择性自噬受体中的LIR基序进行ATACC肽的设计：p62的残基332–343（SGGDDDWTHLSS），NBR1（SASSEDYIIILP）的残基726-737和Optineurin（GSSEDSFVEIRM）的残基172-183。对于CPP，选择了人类免疫缺陷病毒反式激活转录激活剂（TAT）（YGRKKRRQRRR）和聚-D-精氨酸（polyR）（RRRRRRRR）的残基47-57，设计的ATACC肽的序列如图1c所示。生物层干涉测量（BLI）检查嵌合肽（P1，P2，P3和P4）与靶蛋白的亲合力。结果表明四种ATACC肽都可以与αSyn和LC3B结合（图1d）。其中，P1与αSyn和LC3B的亲合力最强， K_D分别为 8.83 ± 0.56 和 14.9 ± 1.2 μM。

图1：（a） ATACC肽诱导的POI靶向降解;（b）ATACC肽的结构图和（c）序列；（d） BLI测定ATACC肽与LC3B/αSyn亲合力

在HEK293T细胞中，四种ATACC肽均能诱导αSyn的剂量依赖性降解，降解能力最强P1的DC₅₀为 46.8 ± 3.7 μM（图2a和2b）。为了阐明P1诱导的αSyn降解的机制，研究人员构建了表达LC3B-EGFP融合蛋白和αSyn-EGFP融合蛋白的HEK293T顺转细胞株，在罗丹明标记的P1共孵育2小时后的细胞成像结果表明，ATACC肽与LC3B和αSyn高度共定位（图2f），佐证了P1能与LC3B和αSyn结合。免疫共沉淀（co-IP）和细胞热迁移（CETSA）实验也进一步验证这些相互作用(图2c-2e)。

图2：（a）免疫印迹测定P1对HEK293T细胞中αSyn的降解作用;（b）P1、P2、P3 和 P4的剂量-效应曲线和DC₅₀值；（c）FLAG-P1和（d）P1处理后，HEK293T细胞中LC3B和αSyn的Co-IP分析；（e） CETSA实验；（f）RhoB-P1处理表达LC3B-EGFP或αSyn-EGFP的HEK293T细胞2小时后的激光共聚焦成像

接着，研究人员评价了P1对SH-SY5Y细胞系的保护作用。激光共聚焦和细胞流式结果表明，在P1处理后，细胞中的活性氧ROS水平回落（从175.4±8.4下降到127.7±17.3%，图3a-c），而线粒体膜电位ΔΨm水平升高（从45.02±5.04提高到61.65±3.35，图3d-f）。此外，CCK-8实验结果表明P1以剂量依赖性方式挽救了αSyn过表达引起的细胞死亡。这些结果表明，P1可以抑制αSyn介导的ROS生成和ΔΨm损失，以保护SH-SY5Y细胞免受αSyn相关毒性影响。

图3：（a）激光共聚焦成像；（b）不同条件下DCFH-DA染色SH-SY5Y细胞的FCM直方图；（c） 对（a）中的图像进行定量分析；（d）激光共聚焦成像；（e）不同条件下JC-1染色SH-SY5Y细胞的细胞流式散点图；（f）对（d）中的图像进行定量分析;（g）不同条件下SH-SY5Y细胞的CCK-8测试结果

最后，研究人员使用MPTP（1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）诱导的PD小鼠模型评估P1的表现。在静脉注射P1（50 mg·kg^–1·d^–1）5天后，进行生化分析和组织学评估（图4a）。免疫组织化学（IHC）染色和免疫印迹分析表明， P1处理后，小鼠黑质致密细胞（SNc）中的αSyn水平降低（图4b-e）。此外，Nissl 染色显示 SNc 中神经元的活力有所改善（Nissl 小体密度增加，图 4f）。而FluoroJade B （FJB） 染色显示 SNc 中受损神经元减少（图 4g，i）。此外，行为学实验的结果表明P1的给药挽救了MPTP诱导PD小鼠的认知障碍。

图4：P1在MPTP诱导的PD小鼠模型中的治疗效果

小结

该论文作者报道了“自噬体锚定嵌合物（ATACC）”技术，设计合成了一系列ATACC肽，并评估了它们与靶蛋白的亲合力和透膜性，验证了它们可通过“化学诱导的货物识别-ALP降解”机制可以有效地降解αSyn。这项研究不仅展示了一种治疗突触核蛋白病的潜在策略，还提供了一种新的靶向蛋白降解工具，拓展了靶向蛋白降解技术的工具库。

参考文献

【1】Yichen Tong, Wentao Zhu, Jian Chen, Wenqian Zhang, Fang Xu, and Jiyan Pang. Targeted Degradation of Alpha-Synuclein by Autophagosome-Anchoring Chimera Peptides. Journal of Medicinal Chemistry 2023 66 (17), 12614-12628. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c01303.