Nat Commun：单细胞水平检测染色体外环状DNA多样性及复杂性的新工具scCircle-seq

导读

染色体外环状DNA（eccDNA）是一类游离于染色体外的环状DNA，广泛存在于包括人类的各种真核生物中，参与调控基因的表达、细胞增殖、DNA损伤修复、肿瘤发生等多个生物学过程；其不易被核酸酶降解，结构更加稳定。目前，研究eccDNA主要方法有DNA荧光原位杂交（FISH）、批量全基因组测序（WGS）和Circle-Seq三种。前两种方法只能检测来自相对较大的基因组区域丰富的eccDNA，Circle-Seq能够识别广泛的eccdna但需要较大数量的细胞进行测序分析。 

因此，目前亟需开发通用、可扩展的方法来检测从组织活检中提取的单个细胞或细胞核中的eccDNA，以揭示eccDNA的生物学复杂性，并阐明其在患者来源肿瘤样本中的异质性。

近日，瑞典卡罗林斯卡医学院的科研人员在Nature Communications杂志发表了题为“scCircle-seq unveils the diversity and complexity of extrachromosomal circular DNAs in single cells”的文章。研究团队开发并验证了Circle-seq的单细胞应用scCircle-seq，该方法适用于非固定和固定的细胞或细胞核，包括从肿瘤活检组织中提取的细胞核。研究显示，大多数eccdna在同一类型的细胞之间高度可变，且更倾向于在扩增基因组区域形成；将scCircle-seq应用三种不同癌症类型肿瘤样本中，发现肿瘤特异性的ecDNA图谱和具有不同ecDNA基因组模式的亚克隆群。综上，scCircle-Seq是一种易于扩展、直接和通用的方法，有望揭示癌症中eccDNA的生物学复杂性和异质性。

文章发表在Nature Communications

主要研究内容

scCircle-seq的实施和技术验证

为开发scCircle-seq，研究团队在Circle-Seq流程的基础上引入了一个额外的DNA缺口修复步骤，以提高eccDNA的检测效率，并设计了一个通用的工作流程，适用于在多孔板或单管中分选的活细胞和固定细胞或细胞核。为分析scCircle-seq数据，研究团队改编了先前用于分析大规模Circle-Seq数据的生物信息学流程：该流程首先搜索具有高测序覆盖度的基因组区域（即产生eccDNA的基因组区域，CPRs），然后通过搜索映射在CPR内的过度表示的不一致和分裂reads对，确定每个CPR内的所谓嵌合连接。此外，研究团队还检测了scCircle-seq的特异性，结果显示与预期一致。

研究团队将scCircle-seq应用于5个不同的细胞系进行分析，包括4个癌症衍生细胞系（HeLa、K562、Colo320DM和PC3）和1个永生化正常细胞系（293T），鉴定出的CPRs数量和相应基因组覆盖率在单个细胞和细胞系之间各不相同，这与已发表的Circle-Seq数据一致，表明大多数eccDNA在细胞间表现出显著的差异，并且在细胞分裂过程中以随机方式遗传。

图1. scCircle-seq工作流程及数据验证。

单细胞中eccDNA的基因组图谱

研究团队分析了scCircle-seq检测到的eccDNA的基因组分布，以确定cccDNA是否存在一种模式，发现eccDNA在单细胞水平上变化极大，但在群体水平上可能检测到更明确的模式。根据同一细胞系所有单细胞中相应CPR的频率以及均匀性评分，研究团队将scCircle-seq鉴定出的eccDNA分成四组进行验证（图2）。结果显示，检测到的eccDNA绝大多数（88-99%）被归类为低频低均匀性（LFLU），少数被归类为高频高均匀性（HFHU），主要存在于Colo320DM、293T细胞中。上述结果表明，eccDNA在本质上是高度异质的，但scCircle-seq能够识别不同eccDNA类型。

研究团队将鉴定的CPRs与各种基因组注释相交，进一步探索scCircle-seq检测到的eccDNA的基因组分布。CPRs在组蛋白H3K9me3（构成性异染色质）和H3K27me3（选择性异染色质）标记的染色质区域富集，表明在异染色质区域中eccDNA的形成更为频繁。

图2. scCircle-seq鉴定的eccDNA的基因组分布。

接下来，研究团队将scCircle-seq与全长scRNA-seq方法Smart-seq2相结合，应用于三种细胞系（Colo320DM、HeLa 和PC3），检查了scCircle-seq检测到的eccDNA拷贝数与其所含基因表达之间的关系。分析显示，基因表达水平与 eccDNA拷贝数之间的相关性较低，但在含有已知致癌基因（如MYC）的大型ecDNA中，其拷贝数与单细胞中相同基因的表达水平呈正相关。

基于eccDNA的细胞类型分类

进一步，研究团队探究了细胞的eccDNA序列是否随机，或者是否可以使用scCircle-seq识别不同细胞类型的eccDNA特征（图3）。首先，研究团队将scCircle-seq检测到的CPRs基因组分布表示为cells×bins矩阵，其中cells是通过scCircle-seq分析的单个细胞的数量，bins是定义长度的连续基因组窗口；然后，使用cisTopic（计算框架）对细胞进行聚类，并使用可用的基因组轨迹对每个聚类进行注释。

结果显示，该方法能够成功地将属于同一细胞类型的所有细胞聚集在一起。此外，分析结果还表明，虽然相同类型细胞之间eccDNA的数量和起源区域存在很大差异，但不同细胞类型具有部分反映其表观基因组的特定eccDNA特征。

图3. eccDNA的细胞特异性。

scCircle-seq应用于患者来源肿瘤样本

研究团队将scCircle-seq应用于从三个回顾性收集的冷冻肿瘤样本中提取的细胞核（1例前列腺腺癌，PRAD；1例三阴性乳腺癌，TNBC；1例管腔B型乳腺癌，LumB），证明了scCircle-seq对患者来源肿瘤样本的适用性。最终，共获得55个PRAD细胞核、87个TNBC细胞核和33个LumB细胞核的高质量测序数据，所有细胞中的环形DNA与线性DNA的比值接近100%，这与从永生化细胞系中获得的结果一致，表明即使在肿瘤活检中提取的细胞核，scCircle-seq也表现良好。

结果显示，PRAD细胞中发现的CPRs数量最多，且CPR覆盖的基因组比例最高，其次是TNBC和LumB，表明这些肿瘤细胞具有不同的eccDNA图谱。此外，研究团队对单细胞CPRs基因组图谱进行UMAP降维分析和差异主题分析，发现PRAD与TNBC、LumB形成两个不同的簇，表明两类肿瘤携带不同的eccDNA基因组，这与其不同的起源组织一致。

研究团队还将LumB细胞和TNBC细胞中鉴定的CPRs与癌症基因组图谱（TCGA）数据库乳腺癌中鉴定的体细胞拷贝数改变（SCNAs）进行交叉分析。结果显示，与TNBC簇2细胞的CPRs相比，扩增区域在TNBC簇1 和LumB细胞的CPRs中显著富集。研究团队还分析了鉴定的eccDNA数量与给定基因组区域的拷贝数关系，发现CPRs的数量在二倍体和中等扩增区域没有显著差异，在扩增水平较高的区域明显更多。上述结果表明，肿瘤细胞的eccDNA分布情况反映出其SCNA情况，并且高度扩增的基因组区域可产生更多eccDNA。

图4. scCircle-seq在患者来源肿瘤样本中的应用。

结 语

综上所述，研究团队开发了scCircle-Seq方法，可以在单细胞水平上分析eccDNA的多样性和复杂性。scCircle-seq利用滚环扩增（RCA）和DNA缺口修复步骤来实现高检测灵敏度，不仅可以检测丰富的、包含癌基因的eccDNA，还可以检测罕见的eccDNA。特别地，scCircle-seq还简化了工作流程，降低了丢失低丰度eccDNA的风险。总之，scCircle-seq是一种可扩展的工具，可用于分析不同细胞和组织类型中eccDNA的复杂性，并有望进一步扩大eccDNA用于癌症诊断的潜力。

参考文献

Chen, J.P., Diekmann, C., Wu, H. et al. scCircle-seq unveils the diversity and complexity of extrachromosomal circular DNAs in single cells. Nat Commun 15, 1768 （2024）. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45972-y.