LABORATORY INVESTIGATION：替代组织固定方案大大减少了DNA伪影的影响

下一代测序（NGS）技术允许检测和评估癌症组织中的遗传改变，它代表了一种日益实践的方法，以满足定制疗法的要求。虽然新鲜冷冻组织的DNA似乎非常适合这种类型的分析，但有几个原因强制使用从常规福尔马林固定石蜡嵌入（FFPE）组织块中提取的DNA。

值得注意的是，具有良好特征的档案材料的可用性，这些材料以标准、可靠和历史悠久的程序收集，甚至存储很长时间（长达几年）。此外，组织学和免疫组织化学（IHC）控制使我们能够选择并相应地提取正确的肿瘤病变。最后，FFPE组织块通常是正确解决治疗相关问题的唯一可用材料。

不幸的是，从FFPE组织块中提取的遗传材料质量差可能会影响NGS数据的可行性和可靠性。在生成FFPE组织块所涉及的不同分析前步骤中，最关键的步骤是福林固定。众所周知，不适当的程序，如延迟、不足或过度固定或使用酸性福尔马林，会影响结果。然而，即使在标准使用中性缓冲福尔马林（NBF）后，广泛的DNA碎片和化学诱导的变化也往往会影响结果。

甲醛与核苷酸碱基的氨基结合。胞嘧啶的去氨可能导致对DNA序列的误解，特别是细胞因子（C）与胸腺嘧啶（T）和鸟嘌嘌呤（G）与腺嘌呤（A）（C:G > T:A）的识别增加。几项研究调查了脱氨过程导致的人工突变的检测，这是错误治疗的潜在原因。然而，假阳性突变仍然是NGS分析从FFPE组织块中提取的DNA的风险，这种材料的广泛碎片进一步增强了这种材料。

事实上，福马林的组织固定已知会产生DNA碎片，但不同组织块的碎片程度各不相同，在这方面，DNA“质量”（即碎片的程度）严重影响遗传分析的结果。几项研究表明，DNA模板的缩小会降低基于扩增子的方法的成功率，甚至导致假阳性数据。

NBF的配方由商用甲醛磷酸缓冲液组成，商用甲醛是一种已知富含甲酸的试剂。后者曾经与NBF中的钠离子有关，通常被认为无效。然而，我们最近表明，去除甲酸可以显著改善DNA保存，这表明缓冲酸残留物可能对DNA产生有害影响。这一发现还得到了以下证据的支持，即基于缺酸的乙醛（仍是一种二醛）的组织固定可以通过保持组织的组织学和免疫表型特征来解决。

关于组织固定对测序结果的真正影响的知识存在差距，特别是当通过全面的基因组分析（CGP）而不是通过小型靶向小组进行测序时，我们解决了这个问题，因此，2023年10月30日发表在LABORATORY INVESTIGATION的研究，解决了这个问题。

研究人员采样了9种结直肠癌，以允许4种平行固定：（1）中性缓冲福尔马林（NBF），（2）缺酸福尔马林固定（ADF），（3）预冷却ADF（coldADF）和（4）无乙二醇酸（GAF）。随后由2个大型下一代测序面板（OCAv3和TSO500）进行DNA提取、碎片分析和测序。本文全面分析了图书馆和测序质量控制以及测序结果的质量。

研究结果显示，coldADF样本的图书馆显示的读取时间明显长，这两个面板的其他图书馆。ADF衍生和ColdADF衍生的库与OCAv3面板的噪声水平最低，一致性最高，其次是GAF和NBF样本。TSO500结果证实了数据的一致性，这也突出了ADF和ColdADF样本总测序区域的最佳性能。与其他协议相比，NBF样本的测序区域明显较小，可评估微卫星位点数量明显减少，单核苷酸变异显著增加。

TSO500面板的输出数据

突变特征1（与老化和FFPE伪影相关）在NBF和coldADF样本中分别显示最高（37%）和最低（17%）值。大多数已确定的基因改变由每个病变的所有样本共享。五种基因在样本和/或面板中表现出不同的突变状态：4个不一致的结果涉及NBF样本。缺酸固定剂（GAF和ADF）保证了最高的DNA保存/测序性能，从而允许组织样本进行更复杂的分子剖析。

综上所述，固定是组织学处理中初步但核心的过程，导致石蜡嵌入组织块的生产，石蜡嵌入组织块是构成病理学档案支柱的最终产品。不同的组织固定方式导致DNA完整性的不同程度，这影响了CGP的输出。ADF保证了整体最高的DNA保存，从而表明可能在组织样本上实施更复杂的分子分析。评估此类样本上DNA随时间的稳定性的长寿研究是必要的。

原始出处

Berrino, E., Bellomo, S. E., Chesta, A., Detillo, P., Bragoni, A., Gagliardi, A., ... & Marchiò, C. (2023). Alternative tissue fixation protocols dramatically reduce the impact of DNA artifacts, unraveling the interpretation of clinical comprehensive genomic profiling. Laboratory Investigation, 100280.