IVD前沿丨纳米孔DNA测序技术在单分子蛋白质组学中的应用

近日，杂志Nature chemistry上发表了一篇题为“Nanopore DNA sequencing technologies and their applications towards single-molecule proteomics”的综述文章。在这篇综述中，作者描述了纳米孔DNA测序的生化创新，并讨论了基于纳米孔的肽测序的技术现状并探索这些进展如何推动未来纳米孔蛋白质测序的发展。

图片来源：Nature Chemistry

ONT (Oxford Nanopore Technologies)核酸测序概述

纳米孔核酸测序已成为一种强大的工具，具有快速读数，高精度，低成本和便携性。纳米孔测序依赖于将单链DNA（ssDNA）的单个分子穿过纳米孔中进行。纳米孔是一种跨膜蛋白，经过人为基因工程修饰后，被嵌入到高电阻率的多聚物膜，在膜两侧加不同的电位就会形成电流。膜上嵌入纳米孔阵列可增加测序通量。

Motor蛋白具有解旋酶活性，将双链DNA解开成单链，并控制ssDNA分子通过纳米孔的速度。ssDNA分子穿过纳米孔时，不同的碱基带来的电流变化不同，被传感器识别并解读。

ONT核酸测序方法。图片来源：Nature Chemistry

其他公司的纳米孔测序技术与ONT的比较

和ONT一样，其他技术利用纳米孔来捕获和检测单个链。但可能使用不同基因或合成的纳米孔，并通过不同酶介导和或不同碱基识别途径获得序列信息。

与经典的ONT纳米孔测序相比，这些方法都有独特的优点和缺点，比如Quantapore系统利用简单生产和稳定的固态纳米孔阵列，然而荧光标记DNA链的所有四个碱基是具有挑战性的（图a）。Optipore和Stratos系统需要高度处理模板DNA来产生二进制序列；相比之下，Genia技术公司使用了一种更简单的纳米标签边合成边测序路线，但由于每个碱基编码标签只被检测到一次，读出精度低于直接链测序。此外，碱基修饰如甲基化，在边合成边测序和其他产生链拷贝的途径，如Optipore和Stratos Genomics中无法检测。

显然，基于纳米孔的DNA测序可以通过多种方法来进行。不同来源的纳米孔可以捕获单链，测序可以依赖于直接阅读链碱基，通过边合成边测序跟踪互补链的聚合，通过破译外切酶生成的标记或核苷酸，或通过标记DNA的映射。读出可以基于离子电流、隧穿电流或荧光。其中一些方法可能会指导蛋白质测序的未来发展。

核算测序的其他纳米孔方法。图片来源：Nature Chemistry

纳米孔蛋白质测序的挑战

纳米孔核酸测序激发了类似的无标记蛋白质分析。然而，多肽的纳米孔测序比DNA和RNA链更具挑战性。首先，蛋白质测序在分析上更为复杂，需要区分20个典型氨基酸以及数百个非蛋白质氨基酸，包括许多翻译后修饰，而DNA测序通常只读取4个碱基。此外，蛋白质的复杂折叠阻碍了多肽链通过纳米孔。另一个问题是缺乏类似于核酸聚合酶链反应（PCR）的蛋白质扩增方法。最后，蛋白质拷贝数的动态范围可以从每个细胞1到107个拷贝，远远高于DNA。

蛋白的纳米孔测序。图片来源：Nature Chemistry

捕获折叠态蛋白

捕获和传感50纳米球状蛋白通常使用比测序~1纳米宽DNA链更宽的孔。~5nm宽的生物孔PlyAB或ClyA可容纳35-kDa蛋白，以及合成可调形状的DNA纳米孔尺寸可达20nm（图e），可以检测到折叠的150-kDa蛋白。甚至更宽，高达100nm，合成孔可以制造成固态膜材料。然而，固态孔有助于感知混合物中的蛋白质，以及表征蛋白质折叠/展开、蛋白质构象变化、酶结合等。这些固态孔隙高度稳定，但详细结构通常无法可靠地大量复制。

与纳米孔的类型和大小无关，折叠蛋白质的捕获和运输通常通过电渗（图f）而不是电泳，在电渗作用中，当小电解质离子以及其周围水壳被电泳驱动穿过水孔腔时，蛋白质被水流带动运输。蛋白质通常会太快地通过大直径的纳米孔，而无法检测。要减缓蛋白速度，可使用“大分子拥挤”纳米孔，带电腔壁，分析物吸附coating，分子识别标签，空间阻塞纳米球，DNA纳米载体引导蛋白质穿孔的固态孔多重传感。其中一些方法可以检测蛋白质的不同形状和体积以及蛋白质进入孔的方向。

折叠蛋白质的捕获。图片来源：Nature Chemistry

多肽穿越纳米孔

多肽通过纳米孔可以通过电泳和分子马达来实现，也可以通过电渗透。非常高的电压可驱动一些高电荷蛋白质的展开。或者，可用带电的变性剂包裹蛋白，还可以将带负电荷的寡核苷酸偶联到单结构域蛋白质上来展开。

比如对杂交纳米孔进行编辑，可进行蛋白质展开和酶切（图a）。这个纳米孔传感器由解折叠酶和蛋白酶体组成。不能提供单个氨基酸的完全分辨率，但可以用于指纹识别蛋白质。

用于肽识别和测序的纳米孔。图片来源：Nature Chemistry

单氨基酸分辨率

早期读取肽的努力集中于检测单个氨基酸。一项研究中，几乎所有的氨基酸都被离子电流扰动来区分。目标氨基酸与短的带正电荷的载体肽相连，通过纳米孔易位（图c）。易位速度足够慢，甚至可以区分结构相似的亮氨酸和异亮氨酸残基。

在最近一项工作中，肽中的氨基酸残基通过使用商用DNA测序技术来测序。目标肽被连接到一条DNA链上，DNA解旋酶Hel308协助杂交链穿过MspA孔（图d），得到了>99.99%的一致测序准确性。DNA介导的肽测序也能检测磷酸化修饰，但目前仅限于少于25个氨基酸的肽。

用于单氨基酸分辨率测序的纳米孔。图片来源：Nature Chemistry

基于非纳米孔的蛋白质测序

非纳米孔技术，包括Edman降解和质谱技术，已经广泛应用于蛋白质和肽测序几十年。最近的改进提高了用于单分子传感的通量和灵敏度。

Edman降解包括修饰一个N端氨基酸及裂解，用于液相色谱检测，并循环重复读取序列。为了解决平行测序这一问题，Edman降解的荧光读出方法被开发出来，提高了该方法的通量。

单分子质谱技术建立在成熟的质谱技术之上。电荷检测质谱（CDMS）方法侧重于分析1-100MDa的大型生物分子复合物，Orbitrap质量分析仪的分辨率有所提高，这些技术极大地扩展了质谱技术，不仅可确认蛋白质的身份，还可以检测翻译后修饰及其在蛋白质序列中的位置。然而，并不是所有的肽都能有效地电离，这可能限制了该技术在蛋白质组学研究中的应用。

蛋白质组学测序展望

下一步可能是在CsgG中进行电渗以获得更高分辨率读取或者利用ClpX介导实现天然多肽链的电渗拉伸，以获得更好的测序精度。这些方法可以发展到测序天然蛋白质更长序列，但挑战仍然存在。一是蛋白质组在化学多样性和动态范围方面的绝对复杂性，需要大规模并行高通量和高分辨率。这同样是下一代LC-MS/MS技术的目标。

另一个挑战是，基于纳米孔的蛋白质组学分析需要从不同的样本进行多路复用。为了将多重蛋白质样品用于纳米孔，现有的肽-DNA偶联测序技术可以使用DNA序列部分来编码样品的识别。也可以通过在蛋白质中添加肽标签来实现，以便通过肽测序或指纹识别来读出。

最后，应该检测到氨基酸的全部信息，包括翻译后修饰。一个挑战是纳米孔信号的复杂性和由于诸如糖基化修饰而导致的多肽过孔的停滞。克服这些障碍，分子马达和电渗可能整合，且纳米孔传感器也需重新设计。分子马达可以与纳米孔阵列相结合，定制设计的纳米孔可以同时对不同长度、电荷和翻译后修饰的肽链进行测序。

纳米孔多肽鉴定和测序的前景非常积极。这曾经被认为是无法实现的，但被该领域许多科学家高度创造性和决心的心态变成了现实。