Nature Methods：北师大章晓辉、王友军团队与中科大唐爱辉团队合作开发新型高灵敏钙信号荧光蛋白探针

2023年4月20日，Nature Methods 学术期刊在线发表了题为 “Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity”的研究论文，该研究成果由北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室的章晓辉团队、生命科学学院的王友军团队与中国科学技术大学的唐爱辉团队合作完成。该研究开发构建了一类检测钙信号的新型荧光蛋白探针NEMOs，具有更强的荧光信号和更精准的定量测定性能。

生命体的许多活动都离不开钙离子（Ca²⁺）信号分子。细胞内钙离子浓度的时空变化被称之为钙信号，它负责控制或调节各种细胞生命活动。开发灵敏和精准的钙信号检测工具（探针），对探究生命活动相关的信号机制和规律至关重要。目前在领域内被广泛应用的钙离子探针主要包括有机小分子类探针和遗传编码的（荧光）蛋白探针（genetically encoded Ca²⁺ indicators, GECIs）。

目前最被广泛应用的单荧光GECI工具为GCaMPs系列，它由钙感知和荧光反应两大模块组装、构建而成。其中，钙感知模块包含钙结合蛋白（如钙调蛋白CaM）及其靶肽（如M13/RS20），产生荧光变化的模块为环化重排的绿色荧光蛋白cpGFP（circularly permuted green fluorescent protein）（图1A）。科学家们发现，通过改变CaM、M13与GFP三个元件之间的连接方式，或修饰连接短肽的氨基酸序列及改变互作界面中的关键氨基酸等方式，可改善GECIs的表现。因此，在2001年最初构建的GCaMP1上多次进行迭代改造后，2023年最新发展的GCaMP8系列已经具备了显著改善的灵敏度和响应速度，但决定信噪比的响应幅度，即对钙信号大小的分辨率和线性动态变化范围，仍亟待提高。

图1、单荧光遗传编码钙探针（GECI）GCaMPs组装（A）与NEMO（B）的组装方式。

北京师范大学的章晓辉团队、王友军团队，联合中国科学技术大学的唐爱辉团队采用全新策略构建新型高灵敏钙离子探针，从而增强GECI对钙离子浓度变化的荧光响应幅度。团队采用亮度更高的新型荧光蛋白mNeoGreen（mNG）来替换广泛使用的cpGFP，结合多种设计及优化策略组合，构建了含几十个候选复合分子的GECI库，并通过系统的钙离子成像筛选和体外鉴定，最终获得了一组名为NEMO的新型GECI探针（图1B，包括NEMO-fast, NEMO-sensitive等）。在研究过程中，解决了镁离子结合降低mNG荧光信号、有效减弱mNG本底荧光信号等多个关键问题。与现有的GCaMP系列探针相比，NEMO探针的灵敏度及钙响应幅度有了非常显著的提升，在领域内首次实现了GECI探针对细胞内钙信号超过100倍的响应幅度；同时具有更好的抗光淬灭能力与pH稳定性，并能实现对钙离子水平的绝对定量检测。

图2、NEMO钙探针在（A）非兴奋性细胞，（B）分离神经元及（C）小鼠在体脑神经元中的反应示例

合作团队进一步在非兴奋性细胞系（图2A）、分离培养的大鼠神经元（图2B）、小鼠脑内神经元在体双光子激光成像（图2C）和深部脑区光纤记录等测试中发现，相比于最新或最广泛使用的GCaMP8s或GCaMP6s，NEMO系列对胞内钙信号的反应速度与之相当，但响应更灵敏且具更高的信噪比，同时响应幅度提高了约10倍之多。

综上，该研究表明NEMO蛋白探针对胞内钙信号或钙依赖的细胞活动幅度具有更高的分辨率，可为检测神经元活动及细胞钙信号的时空变化提供一组性能更优越的钙信号探针。

本项工作受到国家基金委重大研究计划、重点项目及面上项目、国家科技创新2030计划、科技部重点研发计划，以及博士后基金的支持。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01852-9

Li J. #, Shang Z.W. #, Chen J.H. #, Gu W.J. #, Yao L.#, Yang X., Sun X.W., Wang L.Q., Wang T.L., Liu S.Y., Li J.L., Hou T.T., Xing D.J., Gill D.J. Li J., Wang S.Q., Hou L.J., Zhou Y.B.*, Tang A.H.*, Zhang X.H.*, Wang Y.J.* (2023) Engineering of NEMO as calcium indicators with ultra-high dynamics and sensitivity. Nature Methods https://doi.org/10.1038/s41592-023-01852-9 (#: equal contribution; *: corresponding authors)