J Orthop Translat：髌下脂肪垫的DFAT在软骨形成和脂肪形成中的优势作用

年龄和肥胖是众所周知的发生膝骨关节炎(OA)的危险因素。越来越多的证据表明，髌下脂肪垫(IFP)可能通过释放脂肪细胞因子或脂质介质来改变膝关节内的微环境，在膝关节OA的发病过程中发挥积极作用。IFP通常在全膝关节置换术或膝关节镜手术中被移除并作为废物处理，但其在细胞治疗中的潜在应用直到最近才得到认可。

目前，膝关节OA患者缺乏减少软骨破坏或修复受损软骨的有效方法。利用来自IFP的脂肪源性基质细胞(SCs)进行细胞治疗是有希望的，因为它们比来自供体匹配的骨髓和皮下脂肪组织的SCs有更好的软骨分化。IFP可以通过关节镜或手术收集。

此外，在极端情况下，如肥胖或脂肪营养不良，与皮下或内脏脂肪组织相比，IFP的体积变化较小。这一现象进一步支持IFP作为一种代谢稳定的脂肪组织，具有细胞治疗的潜力，特别是在易患膝关节炎的肥胖受试者中。

然而，来自衰老个体的SCs往往表现出增殖和分化的减少，限制了其在细胞治疗中的临床应用。这个问题对于一般为老年人的膝关节炎患者尤为重要。值得注意的是，通过在充满液体和倒置的烧瓶中培养浮力成熟脂肪细胞，也可以获得不同类型的脂肪来源细胞。在天花板培养过程中，成熟脂肪细胞退分化回前脂肪细胞，称为去分化脂肪细胞(DFAT)。由于DFAT本身的高纯度和多能性，已被证明是比SCs更好的细胞治疗或组织工程材料。因此，我们假设来自IFP的DFAT可能能够逃避年龄或体重指数(BMI)介导的影响，并可能作为膝关节OA患者软骨修复的优越细胞来源。

几种发育性HOX基因(HOTAIR、HOXC11、TBX5和HOXA5)在腹部和臀部脂肪库之间存在差异表达，并可能决定其生物学功能。因此，我们测量了这些HOX基因来表征ifp来源细胞的发育特性。为了评估体外脂肪形成状况，采用油红O染色定量细胞内脂滴形成。SRY-Box转录因子9 (SOX9)是软骨细胞分化所必需的关键转录因子，用于评估体外软骨形成。同时定量测定聚集蛋白(ACAN)、侏儒相关转录因子2 (RUNX2)和软骨寡聚基质蛋白(COMP)的水平。ACAN是软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白，COMP是主要存在于软骨中的细胞外基质蛋白。RUNX2是成骨细胞分化所必需的转录因子，在软骨形成过程中也有表达，但对软骨细胞成熟有负面影响。因此，ACAN和COMP可作为良好软骨形成的标志物，而RUNX2则是不健康软骨形成的指标。

迄今为止，只有三篇报道调查了ifp衍生的DFAT (ifp - DFAT)的特征，没有研究比较了不同年龄或BMI组的IFP-SCs和ifp - DFAT。在这里，我们从接受膝关节OA全膝关节置换术的患者中收集IFPs，并分离成对的IFP-SCs和ifp - DFAT。我们的目的是研究年龄和bmi介导的代谢性炎症对IFPs和ifp衍生细胞特征的影响，为细胞治疗和组织工程提供有用的信息。

方法:我们通过分离配对的IFP-SCs和ifp - DFAT收集来自年龄在65岁及以上、体重不同、接受骨关节炎(OA)全膝关节置换术的个体的ifp。流式细胞术检测细胞免疫表型。体外进行脂肪形成和软骨形成。采用Real-time qPCR、western blotting、Oil Red O或Alcian blue染色来评估炎症、脂肪形成和软骨形成。通过RNA测序和海马分析来探索潜在的机制。

结果:我们发现老年或正常体重的膝关节OA患者的IFPs具有促炎作用，并且白细胞介素-6 (IL-6)信号传导与多种免疫相关分子相关，而ifp衍生的细胞可以逃避炎症特性。衰老在降低IFP-SCs的成软骨和成脂肪能力中起重要作用;然而，在ifp - DFAT中可以避免这种影响。一般来说，与配对的IFP-SCs相比，不同年龄或BMI组的ifp - DFAT呈现出稳定的软骨形成状态(受年龄影响较小)，并持续增强脂肪形成。RNA测序和海马分析表明，真核起始因子2 (EIF2)信号的下调和线粒体功能的增强可能有助于改善ifp - DFAT的细胞生物学。

IFP-SCs和ifp - dfat具有独特的发育HOX基因表达，并具有相容的免疫表型。(A)从11例全膝关节置换术的OA患者中收集配对的IFP-SCs和ifpdfat。配对永生化的臀皮下脂肪组织(GSAT)和腹部皮下脂肪组织(ASAT)衍生的基质细胞(n¼3;技术重复)比较发育HOX基因与IFP-SCs和idp - dfat的表达(n¼11;生物复制)。采用实时荧光定量pcr检测臀脂肪库中表达升高的两个HOX基因(HOXC11、HOTAIR)和腹部脂肪库中高表达的两个HOX基因(HOXA5、TBX5)。所有细胞均在亚融合增殖下收获。将基因归一化为参考转录物:GAPDH。数据分析采用单因素方差分析(single -way ANOVA)，并以mean 扫描电镜。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。(B)流式细胞术通过逐步筛选CD31 ， CD45和cd90 /73/105 (þ)的细胞进行。(C)流式细胞术检测IFP-SCs和ifp - dfat中细胞表面标志物(CD73、CD90、CD105、CD31和CD45)的表达。汇总表中显示了每个标记的平均百分比。数值以平均值表示±5个独立实验的SEM。

年龄和BMI对膝关节OA患者IFPs炎症特性的影响。(A) Real-time定量PCR检测IFPs中IL-6和IL-8表达与年龄或BMI的相关性，采用Spearman相关检验。(B)比较IFPs、IFP-SCs和ifpdfat中IL-6和IL-8的水平，将受试者分为老年组和年轻老年组或正常体重组和肥胖组。数据分析采用单因素方差分析(single -way ANOVA)，并以mean 扫描电镜。(C)通过对肥胖年轻老年膝关节OA患者(n¼2)的IFPs和正常加权老年膝关节OA患者(n¼2)的IFPs进行rna测序，共鉴定出112个DEGs(67个向下和55个向上)。使用IPA软件分析了112个DEGs的功能特征，列出了前5个典型途径、分子和细胞功能以及生理系统发育和功能。(D)绘制了国际音标图表摘要，以说明分析中预测的最重要和最主要的生物学主题之间的联系。(E) IL-6被预测为IPA的上游抑制剂，并显示了其可能的下游靶点。*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001。

RNA-seq分析评估ifp - dfat和IFP-SCs之间deg的功能富集。(A)通过IPA分析，确定了肥胖青年老年膝关节OA患者中ifp - dfat和IFP-SCs之间受99℃(71℃，28℃)显著调节的顶级典型途径、分子和细胞功能以及生理系统发育和功能。(B)绘制了一个图形摘要，概述了99°g的IPA核心分析中预测的主要相关生物学主题。(C)在99个DEGs的IPA分析中，EGF被预测为上游抑制剂，并显示了其可能的下游靶点。(D) IPA分析确定了正常体重的老年膝关节OA患者中ifp - dfat和IFP-SCs之间受351度(向下174度和向上177度)显著调节的顶级典型途径、分子和细胞功能以及生理系统发育和功能。(E)绘制了一个图形摘要，概述了在351°g的IPA核心分析中预测的主要相关生物学主题。(F)在351°g的IPA分析中，SMAD3被预测为上游激活剂，并显示了其可能的下游目标。(G)根据评分比较了肥胖青年-老年组和正常加权老年组之间功能丰富的典型通路(ifp - dfat与IFP-SCs)。

海马分析配对的IFP-SCs和ifp - dfat以评估线粒体功能。(A)将两名肥胖青年和两名体重正常的老年膝关节OA患者的配对IFP-SCs和ifp - dfat依次暴露于寡霉素、羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)和鱼烯酮/抗霉素A中，以获得线粒体呼吸的几个参数。纵虚线表示添加线粒体抑制剂的时间。(B)线粒体参数，包括基础呼吸、最大呼吸、ATP生成、质子泄漏、非线粒体氧呼吸和备用呼吸能力，比较了肥胖青年-老年人和正常体重老年人的IFP-SCs和ifp - dfat。OCR:耗氧量。数据分析采用单因素方差分析(single -way ANOVA)，并以mean扫描电镜。(每种细胞类型n¼3)。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。

结论:我们的数据表明，与IFP-SCs相比，ifp - DFAT在软骨分化和脂肪形成方面是优越的细胞材料，特别是在老年膝关节OA患者中。本文的转化潜力:这些结果为ifp - DFAT用于膝关节OA患者的细胞治疗或组织工程提供了一个新的概念和支持性证据。利用RNA-seq数据的Ingenuity Pathway Analysis (IPA)和线粒体代谢参数的Seahorse分析，我们强调了一些分子、信号通路和线粒体功能可能是共同协调的，以确定ifp - DFAT中增强的生物学功能。

文献来源：

Sun YC,  Shen PH,  Wang CC, DFATs derived from infrapatellar fat pad hold advantage on chondrogenesis and adipogenesis to evade age mediated influence.J Orthop Translat 2023 Sep;42