Int Immunopharmacol：大叶茜草素可有望成为脓毒症的候选药物

脓毒症是一种与巨噬细胞过度活化相关的危及生命的器官功能障碍。据估计，全球每年有31万例脓毒症和5万例严重脓毒症，可导致近19万人死亡。脓毒症的早期阶段，巨噬细胞作为早期免疫系统的一部分，被一系列促炎刺激激活，大量促炎细胞因子和趋化因子的释放会加剧患者的炎症反应，并可致多器官功能障碍综合征（MODS）。鉴于此，针对巨噬细胞的过度活化被认为是一种很有前景的治疗策略。

大叶茜草素（Mollugin, MLG）是茜草（Rubia cordifolia L.）的主要活性成分之一，已证明有抗炎、抗病毒和抗癌作用。研究表明，MLG可以通过阻断JAK-STAT通路的激活来抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。此外，MLG可通过抑制TNF-α阻断NF-κB信号通路的激活。作为一种抗炎剂，MLG已被证明可通过抑制促炎性细胞因子的产生来预防盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的小鼠脓毒症。然而，MLG介导抗炎活性的确切分子机制仍然未知。

日前，一篇发表在《International Immunopharmacology》杂志，名为“Mollugin prevents CLP-induced sepsis in mice by inhibiting TAK1-NF-κB/MAPKs pathways and activating Keap1-Nrf2 pathway in macrophages”的论文探讨了MLG通过抑制巨噬细胞双重生物学机制预防CLP诱导的小鼠脓毒症。

图1 论文首页

MLG在体外有效地抑制LPS诱导的NO产生

CCK-8分析证明MLG（图2A）对RAW 264.7细胞的细胞活力有最小的影响（图2B）。NO检测结果表明，MLG可剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中的NO产生（图2C）；MLG能显著抑制用LPS或TNF-α刺激的小鼠原代腹腔巨噬细胞（PM）中的NO产生（图2D，F）；MLG能明显抑制TNF-α诱导的RAW264.7细胞NO生成的增加（图2E）。以上结果提示，MLG具有明显的抗炎作用，其机制可能与抑制巨噬细胞NO的产生有关。

图2MLG抑制LPS或TNF-α诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应

MLG减少小鼠巨噬细胞中促炎基因的表达

如图3所示，与LPS组相比，MLG不仅降低了NOS 2 mRNA（编码iNOS蛋白）的表达水平（图3A），而且降低了iNOS的表达水平（图3B-C）。RTqPCR进一步显示MLG抑制LPS处理的巨噬细胞中包括TNF-α（图3D）、IL-1β（图3E）和IL-6（图3F）的促炎基因的mRNA水平。这些结果为MLG在LPS处理的RAW 264.7巨噬细胞中抗炎活性提供了进一步的证据。

图3  MLG抑制LPS刺激的小鼠巨噬细胞中促炎基因的表达

MLG通过抑制NF-κB信号通路减轻炎症反应

 通过荧光素酶报告基因测定发现，MLG可以抑制TNF-α处理的293 T细胞中的NF-κB荧光素酶（图4A）。同时，在MLG预处理组中，LPS刺激的RAW 264.7细胞中p-TAK1和p-IKKα/β的水平（图4B-C）显著降低；LPS刺激诱导IKK介导的IκBα磷酸化后的泛素/蛋白酶体依赖性IκBα降解进而激活NF-κB信号通路的过程被显著抑制（图4D等）。

此外，LPS处理还增加了核部分中NF-κB p65亚基的水平，同时相应地减少了胞质部分中的NF-κB p65亚基的水平（图4E等），表明NF-κB信号转导的激活。MLG处理可有效抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞NF-κB p65核转位。总之，MLG是NF-κB信号通路的有效抑制剂。

图4  MLG在体外抑制NF-κB信号通路的激活

MLG通过抑制MAPKs信号转导抑制LPS诱导的炎症反应

如图5所示，MLG可分别降低RAW264.7细胞中的p-ERK（图5A-B）/p-JNK（图5C-D）/ p-p38（图5 E-F）的水平，这与对所示激酶的特异性抑制剂的作用相当。这些结果表明MLG调节LPS刺激的RAW 264.7细胞中MAPKs信号通路，即LPS刺激后，MAPK信号通路被激活，包括增加ERK，JNK和p38在RAW 264.7细胞中的磷酸化。

图5 MLG对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中MAPK通路的磷酸化信号转导的抑制作用

MLG激活Keap 1-Nrf 2信号通路介导抗氧化反应

 Keap 1-Nrf 2途径是对抗炎症的经典抗氧化途径，为此探讨了MLG是否可以激活Keap 1-Nrf 2通路。结果如图6A所示，MLG剂量依赖性地激活HEK 293 T细胞中的ARE-荧光素酶活性。

接下来，研究者还检测了Keap 1-Nrf 2通路中关键因子的表达。虽然Keap 1蛋白水平没有显著变化，但在MLG中观察到Nrf 2和HO-1蛋白水平以剂量依赖性方式增加（图6B等）。同时，研究者还使用免疫荧光染色来显示当RAW264.7细胞暴露于姜黄素或MLG时Nrf 2的核转位（图6C，补充图1F）。此外，MLG减少了LPS诱导的RAW264.7细胞中ROS的产生（图6D-E）。

以上结果表明，MLG可以通过激活Keap 1-Nrf 2通路来保护免受氧化应激。

图6  MLG在体外诱导激活 Nrf2 通路

MLG与TAK1和Keap1相互作用

TAK 1是负责NF-κB和MAPK通路活化的关键上游激酶，为此研究者进行了CETSA分析以研究MLG是否与TAK 1相互作用。如图7A所示，MLG可明显降低TAK 1在RAW264.7细胞裂解液中的热稳定性，这表明MLG可有效地与TAK 1蛋白结合。

而分子对接则显示，MLG可分别通过与Asp 175形成氢键，与Val 50、Ala 61和Leu 163形成疏水作用，进而与Lys 63形成盐桥，再与TAK 1完成结合（图7C）。进一步，通过CETSA发现，MLG显著降低了RAW264.7细胞裂解物中Keap 1的热稳定性（图7B），这意味着MLG和Keap 1之间存在直接相互作用。

此外，分子对接还显示，MLG可分别通过与Phe 139和Ala 143形成氢键，与Thr 60、Lys 61、Phe 64和Ala 143形成疏水相互作用，以及与Phe 64形成π-堆叠来靶向Keap 1（图7D）。

总之，MLG可能与TAK 1和Keap 1相互作用，从而分别抑制NF-κB和MAPKs的活化，并诱导Nrf 2的活化。

图 7 预测 MLG 与 TAK1 和 Keap1 的相互作用

MLG改善CLP诱导的小鼠败血症

为了评估MLG在体内的抗炎作用，研究者建立了CLP诱导的脓毒症模型。结果显示，与CLP组相比，在MLG处理下CLP小鼠的死亡率呈浓度依赖性降低（如图8A），此外，与CLP组相比，MLG的给药显著减少了小鼠的体重损失（图8B）。H&E 染色显示，与CLP组相比，经MLG处理的小鼠肺部和肝脏的器官损伤得到了缓解（图8C）。IHC结果表明，与CLP组相比，MLG处理组在肝脏和肺组织中F4/80或CD 11b标记的巨噬细胞水平降低（图8 D-E，以及原文补充图2A-D）。

此外，Diff-Quik染色显示，在受到LPS挑战的小鼠中，BALF中肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞的数量明显升高，而腹腔内给予MLG或DEX显示出对BALF中这三种细胞异常增加的显著抑制（具体见原文补充图3A-E）。这些数据表明，MLG通过抑制巨噬细胞介导的炎症，在CLP诱导的脓毒症小鼠中表现出了保护作用。

图8 口服 MLG 可改善 CLP 诱导的小鼠败血症

MLG抑制CLP诱导的脓毒症小鼠中促炎细胞因子的表达

在脓毒症的发病机制中涉及了几种促炎细胞因子和介质。如图9A-C所示，在CLP后72 h，CLP组小鼠肝脏中NOS 2、IL-1β、TNF-α的mRNA水平显著上调。与此同时，经MLG处理的CLP小鼠表现出上述基因的显著下调表达。ELISA结果显示， IL-1β和TNF-α的水平在CLP后小鼠血清中显著增加，而MLG有效地抑制它们的释放（图9D-E）。因此，研究者得出结论，MLG可以缓解CLP诱导的小鼠脓毒症中的炎症反应。

图 9  MLG 可减少 CLP 诱导的败血症小鼠体内促炎细胞因子的产生

结论

总之，本研究表明MLG在体外可抑制LPS或TNF-α诱导的炎症，并减轻CLP诱导的脓毒症。从机制上讲，MLG通过抑制NF-κB/MAPK炎症信号传导和激活Keap 1-Nrf 2抗氧化途径发挥其保护作用。总体而言，MLG可能是治疗脓毒症的有价值的候选药物。

参考文献：

Liu X, Shen X, Wang H, Wang J, Ren Y, Zhang M, Li S, Guo L, Li J, Wang Y. Mollugin prevents CLP-induced sepsis in mice by inhibiting TAK1-NF-κB/MAPKs pathways and activating Keap1-Nrf2 pathway in macrophages. Int Immunopharmacol. 2023 Dec;125(Pt A):111079. doi: 10.1016/j.intimp.2023.111079. Epub 2023 Oct 27. PMID: 38149576.