Circulation 中国医学科学院阜外医院聂宇教授团队提出心肌细胞表型分析新维度

心肌细胞增殖是心肌再生的核心环节，准确评估心肌细胞增殖能力对于研究心肌再生至关重要。心肌细胞染色体倍性(Ploidy)，即细胞核中DNA含量的倍数，是评估心肌细胞增殖能力的重要指标。胚胎期心肌细胞具有较高的增殖能力，这一阶段的心肌细胞通常是二倍体(Diploid)，含有两套染色体(分别来自母本和父本)。出生后，随着心肌细胞的成熟，它们的细胞核会发生倍性变化，转变成为多倍体(Polyploidy)状态。相比于二倍体心肌细胞，多倍体状态限制了心肌细胞通过正常的细胞周期进行分裂的能力；基于心肌细胞核倍性可以有效判断心肌细胞增殖能力。此外，多种心血管疾病引发的心脏重构也会导致心肌细胞染色体发生多倍体化。而心脏左室辅助装置植入后，伴随心脏功能恢复，会呈现心肌细胞染色体倍性减低的现象。因此，准确测定心肌细胞染色体倍性对于评价心脏再生、心功能恢复以及心脏病理状态等具有重要的价值。

目前领域内主要使用两种指标检测心肌细胞染色体倍性：荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)和细胞核染色荧光密度分析。(一) FISH技术是检测细胞倍性的金标准，但其实验难度大、实验成本高，心肌细胞天然的致密肌节结构使FISH实验在心肌细胞的杂交效率极低，这对实验人员操作经验、实验周期都提出了挑战。譬如：一张心肌细胞涂片的FISH实验，操作周期长达2-3天；由于探针昂贵，一张细胞涂片的实验成本往往超过2000元人民币，一张片的拍摄时间也需要2个小时；并且FISH实验不能应用于组织切片中评估心肌细胞，应用场景有限。(二)细胞核染色荧光密度分析用以评估细胞倍性则存在荧光强度差异、淬灭不均匀、批次效应强、准确度差、实验结果不稳定等问题；并且同样不适用组织切片。

为了解决心肌细胞倍性检测这一难题，中国医学科学院阜外医院聂宇教授团队提出了心肌细胞核体积和染色体倍性的数学分割模型，成功开发了实验成本低、准确性高、可重复性强的心肌细胞倍性评估新方法，为心肌细胞核的体积赋予了生物学意义，提出了心肌细胞表型分析的新维度；同时为评估心肌细胞增殖和心肌再生能力提供了新工具。2024年5月7日，相关成果发表于Circulation, 题目为“Identifying Cardiomyocyte Ploidy With Nucleus Area and Volume”。

在分析心肌细胞成熟度和增殖能力过程中，研究人员发现成年小鼠的心肌细胞核数量不一，且细胞核大小各异(图1)。细胞核是染色体的存储场所，研究人员推测细胞核体积大小与DNA拷贝数及组蛋白的含量存在对应关系，并据此提出：通过测量心肌细胞核体积有可能可以实现对染色体倍性的定量分析。

图1. 成年小鼠心肌细胞核

为了实现这一目标，研究人员分离了成年小鼠心肌细胞，利用FISH实验确定每一个心肌细胞的染色体倍性，作为基准真实值(Ground Truth)。结果显示，可以在心肌细胞中检测到不同染色体倍性，包括二倍体(2n)、四倍体(4n)、八倍体(8n)等(图2)。

图2. 不同染色体倍性的心肌细胞

为了检测心肌细胞核体积，利用Imaris软件对心肌细胞核进行三维重建，继而计算心肌细胞核体积。研究人员发现，心肌细胞核的体积在统计上呈现二项分布(图3)，这种分布与染色体倍性(如2n、4n、8n)遵循相同的数学模式。

图3. 心肌细胞核体积呈现二项分布

在此基础上，研究人员比较了不同年龄阶段(14天龄、1月龄、3月龄、6月龄、12月龄、24月龄)小鼠心肌细胞核体积。结果显示，心肌细胞核体积的这一数学模式具有普适性，不会受到出生后心脏发育和心肌细胞成熟的影响。通过整合所有年龄段心肌细胞的核体积数据，研究人员统计出了评估染色体倍性的最优分割系数(1.5)。基于该系数，利用核体积评估心肌细胞染色体倍性的准确性可以达到99%，F1 score可达0.96 (图4)。

图4. 心肌细胞核体积评估染色体倍性准确性分析

为了确认在心脏组织切片水平，细胞核体积是否同样适用于评估心肌细胞染色体倍性。研究人员，收集成年小鼠心脏制备组织切片，利用PCM1特异性标记心肌细胞核。基于DAPI核荧光染色和激光共聚焦显微镜拍摄图片，进行心肌细胞核体积测量。结果显示，组织层面心肌细胞的核体积与分离的心肌细胞不存在体积差异，证明分离心肌细胞的过程不会导致心肌细胞核的体积发生变化，组织切片层面同样可以使用分离心肌细胞建立的染色体倍性函数模型(图5)。由此可见，基于细胞核体积评估心肌细胞染色体倍性的方法不仅适用于分离的心肌细胞，也适用于心脏组织切片，且绕开了心肌组织自发荧光的困难，同时不受荧光淬灭等因素的干扰。

图5. 心脏组织切片的心肌细胞核体积测量和染色体倍性评估

此外，为了探讨这一心肌细胞染色体倍性评估方法是否适用于分析心肌组织的病理状态，研究人员构建小鼠主动脉弓缩窄模型诱导心肌肥厚。结果显示，心肌细胞核体积测量发现，肥厚心肌组织的心肌细胞出现了核体积的增大。FISH结果显示，肥厚心肌组织的心肌细胞染色体倍性显著增加。通过比较分析，研究人员证实细胞核评估倍性的准确度与FISH实验结果(金标准)一致，具有相同的特异性和敏感性(图6)。

图6. 心肌细胞核体积评估肥厚心肌组织染色体倍性变化

综上，该研究首次建立了心肌细胞核体积与染色体倍性的数学关系，为心肌细胞表型分析提供了新维度，赋予心肌细胞核体积明确的生物学意义。相较于FISH实验，基于心肌细胞核体积评估染色体倍性，在保证准确度的同时，实验周期缩短至数小时，实验成本降至十几元人民币，拍摄分析时间也大幅减少，并且适用于心脏组织切片分析。

聂宇教授课题组长期从事内源性心肌细胞增殖和原位心肌再生研究，先后解析了巨噬细胞(Circulation. 2020. 142(10):967-982)和细胞外基质(Circulation. 2023. 149(13):1004-1015)在调控心肌再生的关键作用与机制。这一研究在前期工作基础上，攻克了心肌再生研究中心肌细胞增殖能力评估的技术难题，为推进心肌再生研究领域的发展提供了重要工具。

北京协和医学院4+4临床医学试点班博士生要泽昊、中国医学科学院阜外医院助理研究员白丽娜博士为该文第一作者，中国医学科学院阜外医院聂宇教授和窦克非教授为该文的共同通讯作者。该工作得到国家重点研发项目、国家自然科学基金、中国医学科学院医学科学创新工程、北京市自然科学基金等资助。

原文链接：

Identifying Cardiomyocyte Ploidy With Nuclear Area and Volume. 2024. Circulation. 2024. 149(19):1540-1542